Un microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico convencional al que se le adapta un accesorio complementario de iluminación, denominado “fluorescencia”. La fluorescencia acoplada a un microscopio tradicional se le denomina epifluorescencia.diseñan objetivos con lentes de “fluorita” con mayor transmisión lumínica para estos efectos.
La fluorescencia es un miembro de la gran familia de procesos de luminiscencia. En el que las moléculas susceptibles emiten luz a partir de estados excitados. Que son creados electrónicamente por un mecanismo físico (por ejemplo, absorción de luz), mecánico (fricción) o químico. La generación de luminiscencia a través de la excitación de una molécula por fotones de luz ultravioleta o visible es un fenómeno denominado fotoluminiscencia. Este se divide formalmente en dos categorías, fluorescencia y fosforescencia. Dependiendo de la configuración electrónica del estado excitado y la vía de emisión.
La fluorescencia es la propiedad de algunos átomos y moléculas para absorber la luz a una longitud de onda particular. Y, posteriormente, emitir luz de onda más larga después de un breve intervalo, denominada vida útil de fluorescencia. El proceso de fosforescencia se produce de manera similar a la fluorescencia, pero con un tiempo de vida excitado mucho más prolongado.
¿Cómo es el proceso de fluorescencia?
El proceso de fluorescencia se rige por tres eventos importantes. Todos ocurren en escalas de tiempo que están separadas por varios órdenes de magnitud. La excitación de una molécula susceptible por un fotón entrante ocurre en femtosegundos (1015 seg). Mientras que la relajación vibratoria de los electrones en estado excitado al nivel de energía más bajo es mucho más lenta; y se puede medir en picosegundos (1012 seg). El proceso final es la emisión de un fotón de longitud de onda más larga y el retorno de la molécula al estado fundamental. Este ocurre en el período de tiempo relativamente largo de nanosegundos (109 seg).
Toda la vida útil de la fluorescencia molecular, desde la excitación hasta la emisión, se mide en solo mil millonésimas de segundo. El fenómeno es una manifestación sorprendente de la interacción entre la luz y la materia. Esta interacción conforma la base de los campos expansivos del estado estacionario y de la espectroscopía y microscopía de fluorescencia de resolución temporal. Debido a los perfiles de emisión tan sensibles, la resolución espacial y la alta especificidad de las investigaciones de fluorescencia, la técnica se ha convertido en una herramienta importante en genética y biología celular.
Primeros microscopios de fluorescencia
Los primeros microscopios de fluorescencia fueron desarrollados entre 1911 y 1913. Por los físicos alemanes Otto Heimstaedt y Heinrich Lehmann como un “sucedáneo” del microscopio ultravioleta. Estos se emplearon para observar la autofluorescencia en bacterias, tejidos animales y vegetales. Poco después, Stanislav Von Provazek impulsó una nueva era cuando usó la microscopía de fluorescencia para estudiar la unión del tinte en tejidos fijos y células vivas. Sin embargo, no fue hasta principios de la década de 1940 que Albert Coons desarrolló una técnica para etiquetar anticuerpos con colorantes fluorescentes. Esto dio lugar al campo de la inmunofluorescencia.
A comienzos del siglo XXI, el campo de la microscopía de fluorescencia provocó una revolución en la biología celular. Este unió al poder de las imágenes de células vivas, el marcado múltiple altamente específico de orgánulos individuales y complejos macromoleculares.
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